1 简介

近年来，阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的治疗研发面临巨大挑战。由于许多神经退行性疾病与蛋白质异常相关，治疗性单克隆抗体（mAbs）成为应对这一难题的重要策略。尽管单克隆抗体在人体外周组织中表现出高度的选择性和有效性，但在治疗中枢神经系统（CNS）疾病时，却面临一个众所周知的障碍：血脑屏障（BBB）。血脑屏障极大地限制了单克隆抗体进入大脑的能力，其脑内浓度通常仅为血清浓度的0.1%到1%。相比之下， 游 离状 态化学药物的脑与血清浓度比可高达100%，若涉及主动转运过程，这一比例甚至更高。

为了评估单克隆抗体（mAbs）在脑组织中的渗透能力，研究人员开发了多种方法。这些方法包括优化脑内相关生物标志物的检测，将其作为评估单克隆抗体疗效的模型，或提高治疗性单克隆抗体进入大脑的递送效率。其中一些方法已显示出一定的潜力。然而，能够准确量化这些脑靶向疗法在其作用部位的暴露水平和效应的方法学进展仍然有限。由于单克隆抗体（mAbs）的作用靶点位于脑细胞周围的间质液（ISF）中，因此ISF是测量单克隆抗体药物浓度的关键区域。目前，大多数临床前研究采用啮齿动物的全脑匀浆测定法来确定单克隆抗体的脑部暴露水平。从临床前物种到人类的转化研究通常依赖于测量和比较两种物种脑脊液（CSF）中的单克隆抗体浓度，然后根据啮齿动物的脑匀浆数据推测人类大脑内的预期浓度。然而，大脑由多个不同区域组成，包括神经元、胶质细胞、ISF、CSF、血液以及血管内皮细胞，这些成分共同构成了一个复杂的混合体。因此，从这些数据中提取抗体在ISF中的“真实”浓度几乎是不可能的。虽然对特定脑区进行解剖分析有助于理解与靶点相关的暴露情况，但这些方法无法适用于大脑的不同区域，因而无法提供关于单克隆抗体在ISF目标区域中药代动力学（PK）和浓度的关键信息。这些信息对于优化抗体设计和候选药物筛选至关重要，能够通过合理的筛选流程将ISF浓度与抗体的理化特性及脑分布途径联系起来，从而提升单克隆抗体的疗效。这不仅有助于确定有效的治疗剂量和给药方案，还能支持评估潜在的替代递送途径（如鼻内或鞘内给药）以改善单克隆抗体在脑部的分布。此外，通过测量单克隆抗体-靶点复合物并分析脑间质液中的药效动力学生物标志物，可以进一步优化治疗策略。

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微透析是一种能够在体内连续测量间质液（ISF）中游离、非结合型分析物浓度的技术。该方法已广泛应用于啮齿动物研究，涵盖大脑、肝脏、皮肤、肾脏和肌肉等多种组织，主要针对小分子化学物质至肽类的研究，但在人体研究中的应用相对较少。目前，研究人员正在改进这一微创取样技术，使其能够采集单克隆抗体（mAbs）等生物大分子。然而，要在ISF中取样并定量测量大分子（如分子量约150 kDa的单克隆抗体），需要使用具有大开孔的取样装置。目前，只有两种ISF取样装置能够满足这一需求：一种是截留分子量（MWCO）约1 MDa的大孔径膜的微透析（MD）探针，另一种是新型装置——脑开放式微灌流（cOFM）探针，其采用由宏观塑料网构成的开放交换结构。由于大开孔探针在实验中会带来显著的环境干扰，目前仅有少数研究团队利用大孔MD探针研究了啮齿动物脑ISF中大分子（包括单克隆抗体）的药代动力学。他们的工作初步验证了微透析技术用于大分子采样的可行性，为了解单克隆抗体在大脑中的分布提供了新思路。随着微透析探针验证工作的推进以及新设备和挑战的不断出现，cOFM探针的使用为拓展研究可能性提供了新的机遇。

本文详细介绍了微透析（MD）和脑开放式微灌流（cOFM）取样装置在清醒、自由活动小鼠脑间质液（ISF）中测量单克隆抗体（mAb）浓度的实验过程及其对比研究（具体实验细节参见文末参考文献）。此外，还重点描述了无菌手术的实施以及多项新型技术解决方案的应用。为了全面研究ISF中药代动力学特性，每次ISF取样实验结束时均采集终末样本（包括脑脊液CSF、血清和脑组织），并进行标准的药代动力学-组织研究，使用与MD和cOFM相同的抗体进行测试（采集CSF、血浆、血清和灌流脑组织）。在这些研究中，选择曲妥珠单抗作为测试分子，主要基于两点原因：其一，曲妥珠单抗与人表皮生长因子受体-2（HER2）结合，但与小鼠无交叉反应，使其在小鼠中成为一种非靶向单克隆抗体；其二，曲妥珠单抗具有临床相关性，目前正被评估用于治疗HER2过表达转移性乳腺癌患者的脑转移。这些临床前研究不仅有助于理解抗HER2抗体在人体大脑中的分布，还为评估两种ISF取样方法在测定单克隆抗体在大脑靶区域内动力学特性方面的潜力提供了重要依据。

2 实验结果

2.1

小鼠大分子ISF取样的实验装置及技术改进

从清醒且自由活动的动物大脑间质液（ISF）中采集大分子治疗物质需要使用高度定制化的ISF取样装置（图1a和1b）。由于采用大孔径或宏观开口的探针，分析物的通过主要依赖于超滤和对流作用，这使得探针对压力变化和灌流液在周围组织中的泄漏更加敏感（图1c和1d）。为了避免探针内部压力积累并确保良好的测试物质回收率，推-拉机制的设计至关重要。传统微透析（MD）方法通常使用独立的推和拉组件，因此在实验开始时需要仔细调整注射泵（推）和蠕动泵（拉）的灌流流速（图1a）。本文描述的cOFM（开放式微灌流）方法采用了一体化的推-拉流路系统，其中推和拉两个组件由单一的蠕动泵头控制（图1b）。这种设计使得推和拉完全同步，无需手动调整。此外，组织间液采样装置还支持双探针植入，这需要每只动物配备两个推-拉系统。每台用于cOFM的泵配备两个泵头，能够通过一台泵同时控制两个独立的推-拉系统（图1b）。

图1. 用于从清醒且自由活动小鼠中采集大分子物质的两种间质液（ISF）取样推-拉装置及相关探针示意图。(a) 微透析（MD）装置包含分离的推/拉流路系统，(c) 配备截留分子量（MWCO）为1 MDa的大孔膜探针。(b) 脑开放式微灌流（cOFM）装置包含同步的推/拉流路系统，(d) 配备开孔尺寸为200 μm的宏观开孔探针。

MD 和 cOFM 系统已升级为配备在线流量计，能够实时监测探针的流出液（图1a和1b）。这使得实验人员能够即时发现流速变化，从而迅速解决实验中的问题，或在事后排除受影响的样本。此外，在线流量监测还能观察样本体积的变化情况。如图2中的代表性曲线所示，探针连接后便开始实时监测流速。当样本体积超出预期体积的10%左右时，可以根据设定的容差范围排除异常样本。例如，在图2的实验中，流速设置为1 μL/min，分段时间为90分钟，因此每段样本的容差范围为80至100 μL。在 Flow 1 中，由于样本体积突然下降，有两个分段被排除，但问题随后得到解决。而在 Flow 2 中，由于流速在整个采样期间波动较大且始终低于容差范围，最终导致该组样本被排除。

图2. 通过在线流量计监测探针流出液的稳定性。流速1（绿色）显示体积随时间变化稳定，始终处于本实验设定的容差范围内。有两个分段被排除（粉色矩形）。流速2（红色）由于探针的实验问题，体积随时间变化非常不稳定。此外，样本分段的体积始终低于容差范围，因此该探针被排除在进一步分析之外。

为了充分发挥微透析技术的潜力，确定探针的最终位置至关重要。MD和cOFM方法都能精确定位大脑区域，从而针对神经疾病展开研究。在本研究中，我们重点关注小鼠的海马体，因为它是与认知过程、学习和记忆密切相关的关键脑区，并且在多种神经退行性疾病中尤其容易受到损害。在MD或cOFM操作后，我们对导向器的植入坐标（包括探针位置）进行了验证；为了进一步研究大脑，首先需要将导向器和探针从组织中取出。经过连续切片和苏木精-伊红（H&E）染色后，由一位经认证的病理生理学家编写了组织病理报告，评估目标区域的达到情况及探针周围组织的状态。图3a展示了具有代表性的冠状脑切片，验证了探针在目标脑区的位置，并与小鼠脑图谱进行了对比。染色结果还可通过整体病理评分来评估组织病理和组织损伤（如坏死、出血、炎症），评分从轻微到显著分级。轻微到中等的评分是可接受的范围；高于该评分的动物数据将被排除。多年来，我们持续监测整体病理评分的演变（图3b）。为了不断改善动物福利并提升数据的科学相关性，我们严格执行无菌手术和无菌实验。这使得动物术后恢复更快，存活率显著提高（从2016年的76%提高到2018年的88%），且术后组织病理减少（2016年中等至显著病理的动物占36%，2018年降至4.8%，见图3b）。总体而言，动物间变异性和实验退出率显著降低，使我们能够排除更少的动物，并增强对数据质量的信心。每次MD和cOFM实验后，我们都会进行这一严格的质量控制。

图3. 探针位置验证及组织病理学质量控制。(a) 大脑切片的组织学染色（H&E），显示采样探针的植入位置。探针明确位于左侧海马区，验证了使用坐标的准确性。组织学染色还可用于评估微透析后的组织病理情况。(b) 艾伯维公司在微透析及无菌手术建立过程中的总体病理评分。根据组织病理学情况，每只小鼠在微透析后都会获得一个总体病理评分。轻度至中度评分处于此类手术操作的常规范围内。超过该评分的动物数据将被排除。

2.2通过经典PK研究MD和cOFM方法的曲妥珠单抗PK谱

单剂量曲妥珠单抗（43 mg/kg）通过腹腔注射（i.p.）或静脉注射（i.v.）的方式在不同类型的体内研究中施用，以研究其在小鼠体内的药代动力学（PK）参数。在给药后的504小时内，我们进行了完整的组织药代动力学筛查，每个时间点的样本量为3只小鼠。随着时间的推移，收集了血清、灌注脑组织和脑脊液（CSF），并测量了这些不同腔室中曲妥珠单抗的浓度。图4a展示了通过此方法收集的曲妥珠单抗完整的丰富采样药代动力学曲线，揭示了实验过程中血清浓度的稳定性。图4b下半部分聚焦于给药后前50小时的数据。药代动力学分析显示，血清中的最大浓度（ C max）在7小时达到，而脑组织和脑脊液分别在50小时和75小时达到 C max（见表1）。脑组织和脑脊液的暴露量相当，其 AUC 0-t分别为542和535 μg·hr/mL。组织/血清浓度比进一步支持了这一点，脑组织和脑脊液的比值分别为0.78%和0.80%（见表1）。由于研究持续时间较短，无法准确评估不同腔室中的半衰期，因此无法根据化合物浓度变化进行准确的半衰期评估。

图4. 曲妥珠单抗在不同腔室中的药代动力学曲线。(a) 曲妥珠单抗在小鼠血清、脑组织匀浆和脑脊液（CSF）中的药代动力学曲线，通过经典的丰富采样药代动力学研究方法获得，在腹腔注射43 mg/kg剂量后，监测了504小时（每个时间点n = 3只小鼠）。(b) 应用后早期阶段的放大（(A)中的橙色框）。(c) 曲妥珠单抗在小鼠脑间质液（ISF）中的药代动力学曲线，通过微透析（MD）（n = 4只小鼠和探头）和开放式微灌流（cOFM）（n = 2只小鼠和探头）获得，腹腔或静脉注射43 mg/kg剂量后，进行连续采样，持续48小时。微透析（MD）测量包括未处理（直接测量数据）和经过修正的浓度（体外回收）。(d) 应用后早期阶段的放大（(C)中的橙色框）。

微透析（MD）和微灌流（cOFM）方法提供了在相同动物体内随时间变化的曲妥珠单抗脑间质液（ISF）自由浓度的补充信息。由于MD探针膜的存在，需要通过实验前后的体外回收率来反推测得的浓度。而cOFM的采样单元采用宏观开口设计，无法使用这种回收率修正方法。图4C展示了使用这两种方法测得的曲妥珠单抗在ISF中的原始浓度，以及经过体外回收率修正后的MD数据。此外，MD实验同时采用了静脉注射（i.v.）和腹腔注射（i.p.）两种给药途径。如图4D所示，数据清晰地展示了两种给药途径下脑间质液吸收的差异：静脉注射后，化合物在12小时（±4.59）达到最大浓度（Cmax），而腹腔注射则在27小时（±7.06）达到Cmax。cOFM仅在腹腔注射条件下进行，与MD不同，cOFM显示出更早的Cmax，出现在给药后17小时（±11.25）（见表1）。通过cOFM和MDBack-calculated测得的小鼠脑间质液中单克隆抗体（mAb）的表观清除率（CL/f）差异不显著（图4c；表1）。然而，AUC0-t和组织/血清浓度比表明，MDBack-calculated和cOFM在腹腔注射下的药代动力学曲线相似：MDBack-calculated的AUC0-t为22 μg·h/mL，ISF/血清比为0.03%；cOFM的AUC0-t为21 μg·h/mL，ISF/血清比为0.03%（见表1）。由于静脉注射后mAb的生物利用度为100%，因此在MDBack-calculated中观察到的ISF暴露量对应于最高可能的水平，AUC0-t为36 μg·h/mL（见表1）。

表1 曲妥珠单抗在不同腔室中的药代动力学参数，单次腹腔注射（i.p.）或静脉注射（i.v.）43 mg/kg剂量后的计算结果。药代动力学参数通过半参数化方法估算，使用电子表格中的一组宏例程（Pharmkin/MS Excel）。下标“Measured”表示测量的浓度，未对数据进行回收修正。下标“Back-calculated”表示对分析物回收进行了修正的数据。

2.3用零流速法对脑间质液中曲妥珠单抗进行绝对定量分析

有趣的是，通过微透析（MD）（包括通过回算修正的回收数据）或微灌流（cOFM）（未进行回算修正）测得的抗体暴露量非常接近（图4c； 表1）。 因此，即使未对cOFM值进行修正（无法考虑体外回收率），这似乎并未显著影响总体暴露量，尽管cOFM测得的单克隆抗体浓度未考虑推拉系统的稀释效应。 这引发了一个问题： 通过回算修正的MD数据是否真正实现了样本中测试物质的绝对定量。 为了解决这一问题，研究人员采用了体内绝对定量方法。 在稳态条件下，进行了零流速法实验，以获得脑间质液（ISF）中单克隆抗体的稳定浓度。 实验中，每只动物的流速逐步增加，从0.1 μL/min逐步提升至0.2、0.3、0.6、1.0、1.5，最终达到2.0 μL/min。 在不同流速之间，设置了1到6小时的平衡期，以确保灌注液与探针周围ISF之间的平衡得以恢复。 收集的各个分馏液经过分析，并绘制了流速与浓度之间的关系图（图5）。 流速通过流量计数据进行了修正，以获得每个分析分馏液的实际流速值。 图5清晰地展示了流速与分析物回收率之间的指数关系，在1和0.1 μL/min的流速下，回收浓度差异超过一个log10。 通过对数据应用一相衰减指数拟合，能够外推出理论零流速下的绝对浓度 C 0 （y = 0）。 在稳态条件下， C 0 为5,813 ng/mL ± 202.7（图5） 。

图5.使用零流速法对曲妥珠单抗在小鼠脑间质液（ISF）中进行绝对定量，在稳态下外推至理论零流速下的浓度（C0）。在静脉注射43 mg/kg剂量后15小时（确保ISF中的稳态浓度），推拉系统的流速逐步从0.1 μL/min增加至2 μL/min，并测量了出口处的回收量（n = 11只小鼠和n = 22个探针）。

在表2中分别报告了微透析（MD）和微灌流（cOFM）方法稳态/终末时间点的浓度（CSS）结果。ISF的CSS值以MD或cOFM测量浓度的最后10小时平均值（未进行回收修正）呈现。ISF的C0根据体外或体内回收计算绝对浓度的不同，分为体外C0和体内C0（分别以蓝色和绿色表示，见表2）。体外C0为898.4 ± 113 ng/mL，而体内C0为5,813 ± 203 ng/mL，两者之间存在6.5倍的差异。因此，单克隆抗体（mAb）的回收百分比因所采用的绝对浓度计算方法而异：在稳态下，MD探针回收了3%的898.4 ± 113 ng/mL（体外C0）和0.5%的5,813 ± 203 ng/mL（体内C0），而cOFM探针回收了35.9%的898.4 ± 113 ng/mL（体外C0）和5.5%的5,813 ± 203 ng/mL（体内C0）。脑组织和脑脊液（CSF）的组织/血清比值在MD和cOFM中保持一致（见表2）。MD方法显示，ISF CSS/血清比为0.01%（在1 μL/min流速下收集），ISF C0/血清比为0.49%。cOFM方法显示，ISF CSS/血清比为0.12%（在0.3 μL/min流速下收集），ISF C0/血清比为2.12%。

表2.曲妥珠单抗单次注射后，终末组织、脑间质液（ISF）及相关回收量的稳态浓度，分别针对微透析和脑开放式微灌流方法进行评估。使用体外或体内回收方法显著影响了小鼠脑中大分子在脑间质液（ISF）中的绝对浓度评估。

3 讨论

确定单克隆抗体（mAbs）等大分子在大脑靶区——间质液（ISF）中的浓度，对于神经活性药物的研发以及具有临床实用价值的生物标志物的识别和验证至关重要。因此，理解单克隆抗体在间质空间中的暴露动力学成为多项治疗研究的核心，这也进一步凸显了开发临床前方法来检测间质液中大分子的必要性。目前，使用膜探针的微透析（MD）技术和采用宏观开孔探针的脑开放式微灌流（cOFM）是应对此类科学挑战的主要技术选择。本研究旨在首次评估并比较微透析（MD）和脑开放式微灌流（cOFM）在收集清醒且自由活动小鼠间质液中单克隆抗体方面的性能。此外，研究还探讨了间质液中绝对浓度这一重要且尚未解决的问题。

这项研究的第一个重点是从技术层面对这两种方法进行比较（图1）。对于大分子微透析（MD）和脑开放式微灌流（cOFM）来说，分析物进入探针的过程都依赖于超滤和对流机制。然而，这两种方法得到的样本类型存在显著差异：微透析（MD）产生的样本是经过滤的，因为大多数大于探针截留分子量（MWCO）的分析物无法通过膜。这一特性导致无法获取间质液样本中包含的所有分子。而脑开放式微灌流（cOFM）由于其开放的交换结构，避免了样本的过滤过程。因此，虽然微透析（MD）对后续分析的要求较低，但脑开放式微灌流（cOFM）提供了更多的采样可能性，不仅能够采集大分子（如单克隆抗体/抗原复合物或免疫活性细胞），还避免了微透析（MD）中常见的生物污染、蛋白质凝结或非特异性结合等问题。

由于本研究中使用的脑开放式微灌流（cOFM）探针开孔较大，微透析（MD）和脑开放式微灌流（cOFM）均面临水分流失的问题，因此需要对渗透压进行校正。实验表明，在灌流液中添加浓度高达10%的牛血清白蛋白（BSA）以增加液体粘度，能够有效防止液体从探针中流失，并提高大分子分析物的回收率。如果不进行适当的平衡，推拉系统产生的内部液压导致的水分流失会稀释探针周围的环境，从而改变其生理状态，使得间质液（ISF）浓度的测量结果偏低。考虑到这些因素，本研究在相应流速下使用了低于推荐浓度的灌流液牛血清白蛋白（BSA）百分比，以平衡BSA对渗透压的益处与其对收集样本成分的潜在不利影响（使用脑开放式微灌流（cOFM）方法在间质液（ISF）中分别测量了含和不含BSA的特定生物标志物，数据未发现显著差异）。此外，将脑开放式微灌流（cOFM）的流速降低至0.3微升/分钟（而微透析（MD）的流速为1微升/分钟），以便在不增加灌流液中BSA百分比的情况下校正对流造成的液体流失。

微透析（MD）和脑开放式微灌流（cOFM）探针都对压力变化敏感，因此需要使用推拉系统。虽然推拉系统有助于解决液体流失问题，但它也会导致收集到的样本被稀释：由于灌流液持续通过探针输送，灌流液和间质液（ISF）之间无法达到平衡。因此，无论是使用微透析（MD）还是脑开放式微灌流（cOFM），收集到的样本中只能回收到一部分分析物浓度。虽然测得的浓度并非绝对浓度，但通过脑开放式微灌流（cOFM）测得的未校正稳态浓度（CSS）比通过微透析（MD）测得的浓度高出10倍以上（表2）。这很可能是由于样本未经过滤，且分析物与探针材料的非特异性结合率较低。与我们的研究结果一致，有研究表明，与微透析（MD）相比，脑开放式微灌流（cOFM）能更有效地回收亲脂性和亲水性小分子物质。这使得在与治疗相关的低剂量下（例如，静脉注射5毫克/千克）研究大脑间质液（ISF）的暴露情况成为可能，同时也为研究非线性药代动力学（PK）过程提供了条件，因为在高剂量下摄取机制（例如，转铁蛋白受体“特洛伊木马”方法）可能会达到饱和状态。

对推拉系统进行校准，以实现最佳的液体回收效果，这对于防止灌流液泄漏到探针周围环境中至关重要。目前最先进的微透析（MD）技术通常使用分离式的推液和抽液组件，在实验前需要对这些组件进行仔细调试。如果校准不当，由于单向对流的作用，可能会导致探针回收率出现人为的增加。这种调试虽然至关重要，但也非常耗时。脑开放式微灌流（cOFM）的供应商开发并采用了一种同步推拉泵，不仅节省了手动调试的时间，还避免了手动调试可能带来的误差。每台这样的泵都配备了两个泵头，因此可以同时控制两个独立的推拉系统。与微透析（MD）的设置相比（即两个微透析推拉系统需要两个注射泵和两个蠕动泵），这种设计在空间占用和操作便利性方面有了显著提升。这种泵也可以轻松应用于微透析（MD）的设置中，从而与文献中记载的现有技术形成区别。

在线流量计的使用为间质液（ISF）采样过程提供了质量控制，同时大幅节省了时间。以往的间质液采样研究通常依赖重量分析法来控制样本，这种方法不仅耗时耗力，还无法在实验过程中实时检测样本体积的波动，从而难以迅速应对潜在问题（图2）。由于实验装置的小型化以及使用了极细的材料，实验过程中可能会因多种原因导致流体流量下降，尤其是位于探针之后的流体系统部分。例如，极细的管道可能会被探针周围环境中的碎屑堵塞，富含间质液的灌流液的粘度可能会偶尔发生变化，或者由于接头松动等原因，空气可能进入流体系统。此外，尽管已尽可能控制实验装置，但其稳定性和完整性仍可能受到动物在笼内持续活动或行为变化的影响，例如管道被卡住或探针脱落。因此，流量计的使用能够在流量下降时及时干预，例如对探针进行短暂冲洗或拧紧所有接头。

在额外的质量控制方面，系统性的组织病理学评估能够在每次实验后准确验证探针的位置，同时评估炎症过程和组织损伤（例如，神经元或小胶质细胞的活性、神经胶质瘢痕的形成）（图3），因为这些因素可能对样本数据的准确性产生影响。例如，受损的血管和神经胶质瘢痕的形成可能会阻碍分析物的交换，改变新陈代谢，或干扰探针周围环境中的信号传导。脑开放式微灌流（cOFM）探针引发的组织反应已得到广泛研究，结果显示，即使在长时间植入后，其影响也微乎其微。迄今为止，在文献报道的间质液（ISF）采样研究中，尚未实施此类质量控制措施。作为对这两种方法的最终技术评估，对大孔径微透析（MD）和脑开放式微灌流（cOFM）进行成本比较后发现，它们的成本几乎相当。

本研究的第二个方面是基于数据对两种收集外源性注射单克隆抗体的方法进行比较。关于曲妥珠单抗药代动力学（PK）特征的基础知识，腹腔注射后的药代动力学-组织筛查（图4a和4b）显示，血清中呈现出典型的单克隆抗体药代动力学特征。随着时间推移，大脑（匀浆）和脑脊液（大池脑脊液）中的暴露水平相当（表1）。必须注意的是，大脑匀浆中测得的浓度很可能是实际单克隆抗体浓度的稀释值，因为抗体仅存在于细胞外空间（即间质液）：匀浆后的脑组织包含细胞内和细胞外介质、脑内皮细胞提取物、残留血液以及残留的脑脊液，是大脑所有区室和细胞组分的混合物。研究结果中观察到的脑/血清以及脑脊液/血清比值，与文献中报道的单克隆抗体典型比值（0.1%-1%）相近。在本研究中，通过肉眼观察大脑并在必要时排除相关数据，来考虑经过仔细脑灌注后的残留血液情况。在研究单克隆抗体在大脑中的分布时，定量校正脑组织中残留血液的浓度是一个非常重要的问题。这是因为这类大分子在大脑中的渗透率非常低，如果不进行校正，会使得其实际浓度偏高。目前，我们正在对脑实质中的血红蛋白和白蛋白进行定量分析，以此来推算可能的血液污染量。不过，使用这种方法时需谨慎，因为已有研究表明，这两种蛋白质也存在于脑细胞中，因此很难准确评估血液污染的程度。

使用微透析（MD）和脑开放式微灌流（cOFM）技术测量间质液（ISF），能够提供关于血脑屏障（BBB）另一侧单克隆抗体（mAbs）浓度的信息（图4c和4d）。在本研究进行的微透析（MD）实验中，不同给药途径之间的差异与预期一致：静脉注射（i.v.）后，间质液（ISF）的暴露量（最大浓度Cmax和曲线下面积AUC）更高，且达到峰值时间（Tmax）更快。间质液（ISF）中单克隆抗体浓度的定量测定与回收率的概念密切相关。回收率反映了探针周围间质液（ISF）中分析物的真实浓度与透析液中浓度之间的关系，由于微透析液通过探针流动，透析液实际上是稀释后的间质液。正如文献中描述的那样，绝对回收率或相对回收率都可以用来定义预期和实际测得的间质液（ISF）浓度之间的关系。由于微透析（MD）中存在膜，导致分析物回收率降低，因此微透析（MD）需要进行相对定量，即使用实验前和实验后的体外回收率来反推计算所测得的浓度。每个探针都计算了一个回收率，我们发现体外回收率在3%到5%之间，每个探针都使用各自的回收率来校正测得的间质液（ISF）浓度（图4c）。另一方面，脑开放式微灌流（cOFM）在进行体外回收率测定时，已显示能够回收100%的分析物：由于其采样单元的宏观开孔，在缓冲溶液中探针的外部与内部隔室之间能够立即建立平衡。这从理论上意味着脑开放式微灌流（cOFM）测得的间质液（ISF）浓度可以视为已经经过回收率校正的浓度。然而，由于体外回收率无法完全反映体内探针周围环境的复杂性，因此应考虑体内的绝对回收率。

如结果所示，使用零流速法测定体内回收率需要间质液（ISF）中的分析物浓度保持稳定，因为这种方法并非对浓度的动态测量，而是基于流速的连续变化。出于同样的原因，零流速法需要使用一组额外的对照动物，通过外推得出的绝对浓度C0来提供曲妥珠单抗的总体回收率。因此，无法像对微透析（MD）进行体外实验那样，对每个探针进行直接校正。考虑到这一点，以及脑开放式微灌流（cOFM）与微透析（MD）相比在体外回收率上的优势，将微透析（MD）反推计算得到的数据的药代动力学（PK）参数与脑开放式微灌流（cOFM）直接测量的数据进行比较（表1），是最适合本研究的策略。

目前，关于间质液中抗体浓度测量的文献数据较为有限，尤其是针对脑开放式微灌流（cOFM）的研究。没有任何研究能够与本研究的数据进行直接对比。在一项针对大鼠的研究中，Chang等人曾报道，通过微透析（MD）技术测量，曲妥珠单抗在腹腔注射后12小时内，纹状体中间质液（ISF）与血浆的浓度比值为0.6%。而在本研究中，通过微透析（MD）和脑开放式微灌流（cOFM）技术观察到，小鼠腹腔注射后48小时内，海马体中间质液（ISF）与血清的浓度比值为0.03%。这种差异可能由多种实验参数引起，例如实验动物种类不同或采样时间范围不同。对于分子量较小（236到780 Da之间）的分子以及更高等的动物（如猴子），使用微透析（MD）技术时，腹腔注射后5小时内，间质液（ISF）与血浆的浓度比值可高达3%。虽然曲妥珠单抗的回收率较高，通过脑开放式微灌流（cOFM）收集的样本浓度并未针对推拉系统造成的稀释因素进行校正。值得注意的是，通过微透析（MD）和脑开放式微灌流（cOFM）技术测量得到的腹腔注射后的浓度、曲线下面积（AUCs）以及组织与血清的浓度比值非常相似。这表明，通过体外回收率计算得出的绝对浓度可能偏低（表1），因此有必要建立一种针对间质液（ISF）的体内回收率测定方法。

除了间质液（ISF）的总体暴露情况大致相似外，使用脑开放式微灌流（cOFM）测得的曲妥珠单抗的药代动力学（PK）特征与微透析（MD）测得的结果存在一些差异：达峰时间（Tmax）（表1）以及随时间变化的浓度，使用脑开放式微灌流（cOFM）测得的结果更低（图4c）。

虽然脑开放式微灌流（cOFM）探针的无膜设计具有一定优势，但这同时也消除了因灌流液流动产生的剪切力物理屏障，可能会影响最初通过在灌流液中添加牛血清白蛋白（BSA）来校正的液体交换情况。因此，建议使用较低的流速（在本实验中，我们采用0.3微升/分钟的流速，而微透析（MD）通常使用1微升/分钟的流速）。即便如此低的流速，仍可能不足以避免探针周围单克隆抗体（mAb）的耗尽，因为随着时间的推移，对大分子分析物的提取速度可能快于其通过复杂的细胞外空间扩散到探针周围环境的速度。使用更低的流速，例如0.1微升/分钟，是解决这一问题的可行后续实验方案，同时也能提高分析物的回收率（以这一流速进行微透析（MD）对小分子的提取率可超过90%）。过去曾有研究尝试使用慢速或超慢速微透析进行绝对定量分析，但作者提到，在如此低流速下使用膜探针会面临技术和实验上的困难。

在这项研究中，成功应用了低流速进行脑开放式微灌流（cOFM）（零流速法）的绝对定量实验。0.1微升/分钟的流速支持了单克隆抗体（mAbs）回收率更高的假设，其提取量平均达到了外推的体内绝对浓度C0的28%（图5）。结果显示，稳态时的绝对浓度远高于最初通过体外回收率计算得出的浓度（表2）。

体外回收率的计算不仅忽略了体内探针周围的各种过程（如吸收、代谢、摄取、细胞内外和毛细血管交换、波动性），而且在使用膜探针进行体外回收率测定时，通常采用的1微升/分钟流速可能远未达到定量提取的效果。此外，体外回收率仅考虑了分析物通过缓冲液和膜的扩散情况，无法准确反映探针在体内的实际性能。已有研究表明，微透析过程中的扩散阻力主要来自外部介质而非微透析膜。总体而言，与体内绝对浓度C0相比（表2），这些因素可以解释为什么通过体外绝对浓度C0计算时（稀释倍数为1/6.5）仍然存在稀释因子。在零流速实验中使用的较低流速（0.1微升/分钟）未能实现“定量提取”（即如对小分子所定义的那样，提取率超过90%），因为只能回收到外推的绝对浓度C0的28%。然而，为了解决在0.3微升/分钟流速下观察到的可能的耗尽效应，这一流速仍值得在完整实验中进行应用。

目前的脑开放式微灌流（cOFM）装置无法进一步降低流速，因为对于清醒且自由活动的动物进行间质液（ISF）采样来说，0.1微升/分钟的流速已经是一个实验挑战。存在的问题包括由于使用Raturn系统导致管道的死体积较大，以及细小内径管道更容易堵塞的风险。或许可以考虑对麻醉状态的动物进行微透析，这样可以将管道长度尽可能缩短到最小。此外，应对通过脑开放式微灌流（cOFM）测得的间质液（ISF）浓度进行动态绝对定量分析。零流速法虽然能提供间质液（ISF）中绝对浓度C0的有价值信息，但这要求间质液（ISF）中的单克隆抗体（mAb）浓度已处于稳态。为了在动态条件下测量单克隆抗体（mAb）的绝对浓度，应考虑其他校准方法，但这些方法需要适用于大分子：离子参考技术此前已用于小分子的测量，其假设是某些离子的回收率与目标分析物的回收率相似。

本研究旨在比较两种经过改进的小鼠体内抗体间质液（ISF）采样方法。这两种系统在技术和实验方面各有优势，同时也面临相应的挑战。此前已有报道指出，使用大孔径膜的微透析（MD）技术在采集大分子时存在一定局限性，而本研究显示，脑开放式微灌流（cOFM）技术能够在一定程度上克服这些局限性。我们首次证明了脑开放式微灌流（cOFM）在采集间质液（ISF）中单克隆抗体（mAbs）方面的重要价值，并揭示了其相较于微透析方法的多个优势。例如，脑开放式微灌流（cOFM）能够采集更大的复合物，并提高分析物的提取率，这不仅在评估治疗性药物在间质液（ISF）中的游离浓度方面具有巨大潜力，还为评估这些药物与靶点的结合情况提供了可能，甚至在低至5毫克/千克的注射剂量下也能实现。这种实验条件下的新潜力有助于评估和完善目前针对神经退行性疾病的治疗策略。例如，通过评估针对特定生物标志物（如tau蛋白、α-突触核蛋白和β-淀粉样蛋白）的单克隆抗体在间质液（ISF）中与靶点的结合情况，同时测试不同单克隆抗体在亲和力、脑内渗透率和清除率方面的差异。该方法还可扩展应用于其他领域，包括RNA疗法、抗体药物偶联物，甚至细胞疗法，因为细胞能够穿过脑开放式微灌流（cOFM）采样单元的塑料网。最终目标是将这些数据外推至人类，为临床提供指导。此外，零流速法首次揭示了在稳态下非靶向结合单克隆抗体在间质液（ISF）中的绝对浓度。应进一步开展实验，评估靶点结合对间质液（ISF）中抗体定量的影响。总体而言，应使用脑开放式微灌流（cOFM）进行更多验证研究，以探索最佳实验条件。当考虑到采集大分子及其他物质时，与微透析相比，脑开放式微灌流（cOFM）方法确实展现出广阔的前景。

发布于：北京市